En 1531 llegó a la región un grupo de españoles encabezados por Hernán Pérez de Bocanegra, procedente de Acámbaro, quienes buscaban un punto de avanzada hacia las ricas regiones mineras del norte, cuya ubicación no estuviera muy lejos de las fértiles tierras del Bajío, para garantizar el abastecimiento de productos agrícolas, por lo que entraron en contacto con Conín, quien fue convertido y bautizado con el nombre de Fernando de Tapia.

Ya estando a favor de la causa de los españoles, se le encomendó a Fernando de Tapia la misión de convencer a los grupos otomíes de la provincia de Jilotepec para apoyar la ocupación y evangelización de la región de La Cañada. Una vez que logró su cometido reunió un ejército y partió de San Juan del Río el 23 de julio de 1531, estableció su campamento en el Cerro Colorado, a la vista del valle de Querétaro y desde allí envió emisarios a sus antiguos amigos chichimecas. Tras varias negociaciones los chichimecas aceptaron someterse a cambio de una condición, sostener un combate con igual número de hombres de cada bando, los cuales estarían desarmados.  Se ha llegado a considerar que condicha petición los chichimecas buscaban salvaguardar su fama de feroces guerreros y así evitar que se esparciera el rumor de que se habían sometido sin dar pelea. 

La batalla se llevó a cabo el amanecer del 25 de julio de 1531, de un lado, otomíes y purépechas bajo las órdenes de Fernando de Tapia y Nicolás de San Luis Montañez; del otro, los chichimecas. Después de varias horas de combate no se vislumbraba un vencedor, sin embargo, por la tarde, el aguerrido grupo chichimeca comenzó a inclinar la situación a su favor.

La tradición cuenta que los españoles angustiados ante una posible derrota solicitaron el auxilio del apóstol Santiago. De pronto, el sol quedó eclipsado, se hizo una densa oscuridad en la cual resaltaba el brillo de las estrellas, se vio claramente la figura de una gran cruz luminosa y, acto seguido, el apóstol, cuya festividad se celebra precisamente el 25 de julio según el calendario litúrgico, hizo su aparición, montado sobre su imponente caballo blanco. Maravillados por el prodigio, los chichimecas cesaron su avance y aceptaron la conversión sin resistencia alguna. Los españoles tomaron posesión del sitio para establecer el poblado que, por sus contribuciones a la corona española, llegó a ser la Muy Noble y Leal Ciudad de Santiago de Querétaro.

Para el año de 1550, la ciudad de Querétaro era paso obligado del tránsito hacia el norte y el occidente novohispano, y adquirió importancia a partir de esta fecha con la apertura del camino a las minas de Zacatecas. Hecho que detonó la economía y el comercio, pero sobre todo se presentaron condiciones para el establecimiento de obrajes, en los que se produjeron productos textiles como telas de lana, algodón, jergas, frazadas, paños y sombreros. Convertidos en hospederías a lo largo del camino, sobresale en el Estado de Querétaro el poblado de San Juan del Río. La hospedería era negocio próspero ante la cantidad de viajeros, hacendados y ganaderos españoles que buscaban instalarse en las inmediaciones del camino, pero sus haciendas y asentamientos sufrieron periódicamente ataques chichimecas hasta 1589.

Para mediados del siglo XVIII Querétaro se había convertido en una urbe con muchas edificaciones valiosas desde el punto de vista arquitectónico. En su arquitectura, tanto religiosa como civil, puede apreciarse un barroco con características propias, de arcos mixtilíneos y cornisas ondulantes. Entre las obras más destacadas están los conventos de San Agustín, el de La Santa Cruz —de los franciscanos de propaganda fide, que tenían a cargo las misiones de Texas—, así como los de Santa Clara de Asís y el de Santa Rosa de Viterbo, ambos de monjas; este último convento alberga obras artísticas excepcionales, como el púlpito, la sacristía y los retablos. Entre las edificaciones civiles de Querétaro encontramos la casa del corregidor Miguel Domínguez, relacionada con los primeros pasajes de la Independencia; la casa de Marquesa, con su patio interior, es una de las mejores expresiones de su tipo en México. Asimismo, la ciudad cuenta con un acueducto de 75 arcos de medio punto, terminado en el año de 1735 y que es uno de los elementos de infraestructura urbana colonial mejor conservados en el país.