Fundado en 1936, es el museo más antiguo e importante de la entidad. Su único antecesor, el Museo Patrio del Estado, estuvo en funciones de 1892 a 1934. Actualmente el Museo Regional de Querétaro cuenta con 5,600 m² de áreas abiertas al público, donde sobresalen las siete salas de exposición permanente (1,659 m²), las tres salas de exposiciones temporales (ocupan 520 m²) y un auditorio con capacidad para 250 personas. El museo ofrece a sus visitantes, a lo largo del año, una gran variedad de actividades: conciertos, exposiciones temporales nacionales e internacionales, coloquios, cursos, talleres, obras de teatro y visitas guiadas, entre otras.

El origen del Museo Regional de Querétaro se remonta a la primera década del siglo XX, durante la administración del gobernador porfirista Francisco González de Cosío, cuando una colección de pinturas proveniente de la Academia de San Carlos fue donada en 1910 a la Academia de Bellas Artes. Dicha colección estaba formada por obras de grandes maestros de la pintura novohispana de los siglos XVII y XVIII, como Baltasar de Echave, Miguel Cabrera y Nicolás Rodríguez Juárez, por mencionar algunos. Esta colección, junto con piezas de templos y bibliotecas conventuales, después de dos procesos sociales y políticos muy complejos —la Revolución y la rebelión cristera—, conformaron el acervo del Museo Regional de Querétaro, fundado en el Ex Convento de San Francisco por Germán Patiño, personaje a quien se debe esta iniciativa y actor fundamental en los primeros trabajos para la protección del patrimonio queretano. El Museo Regional se incorporó al INAH desde el inicio mismo de esta institución (1939), por lo que se convirtió en un recinto de administración federal. Posteriormente, en 1954, se contó entre los museos regionales sometidos a un proceso de reorganización por el Instituto.

El edificio que actualmente ocupa fue en sus orígenes el Convento Franciscano de Santiago, el cual, desde sus inicios en el siglo XVI, fungió como centro rector de la vida social de Querétaro y eje articulador del espacio urbano. Era un enorme complejo religioso que desempeñó, hasta comienzos del siglo XVIII, una diversidad de funciones vinculadas a la vida cotidiana de los habitantes de la ciudad, en virtud de haber sido la primera y única parroquia. Su influencia abarcó más allá de su propio territorio, pues por más de dos siglos fue sede de la Provincia de San Pedro y San Pablo de Michoacán. Por tal motivo, se configuraron en su derredor las estructuras sociales, económicas y políticas que caracterizaron a la sociedad regional en el Virreinato.

A lo largo del siglo XVII el convento experimentó una intensa actividad constructiva; más que un convento, se convirtió en un conjunto religioso. Alcanzó una superficie total de aproximadamente 28,000 m², que lo transformó en una microciudad autosustentable y con actividades, hasta 1803, de formación de novicios y enseñanza de lectura y escritura a los niños pobres. Después de muchos avatares históricos y usos diversos, sobre todo como cuartel en conflictos armados durante y después de las Guerras de Reforma, así como algunos usos civiles y comerciales, el 4 de diciembre de 1928 el inmueble se entregó al gobierno de la entidad para establecer un Museo de Arte Religioso Colonial y una Escuela de Artes y Oficios. En 1935, fue entregado a la Secretaría de Educación Pública.

Desde principios del siglo XX, un grupo de queretanos encabezados por Germán Patiño Díaz asumieron la defensa del monumento como parte de un proyecto integral para la recuperación del patrimonio histórico de Querétaro. Así, en noviembre de 1936 se hizo entrega formal del Museo Regional de Querétaro al señor Patiño, su primer director.

Desde su instauración, el museo ha ido recuperando espacios y ampliando sus funciones. El último proceso de adecuación se llevó a cabo de 1995 al 2009, bajo la dirección de la museógrafa Rosa Estela Reyes, e incluyó aspectos importantes para la labor del museo: reestructuración museográfica, documentación de la colección, catalogación del acervo, proyecto de imagen del museo y atención al inmueble. La intervención a las salas existentes y la adecuación y creación de nuevos espacios museísticos han permitido aprovechar todo el potencial que ofrecen el inmueble y la gran colección con la que cuenta el museo.