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Fue inaugurado en 1981 en el ex Convento de Nuestra Señora de la Asunción, erigido por frailes franciscanos con mano de obra indígena. El templo posee un techo interior único en el país por su artesonado de madera labrada estilo mudéjar con aplicaciones de oro. Fundado en 1528, fue el tercer convento que los frailes españoles construyeron a su llegada: el primero y el segundo fueron los de México y Texcoco; sólo el de Tlaxcala permanece. Cuenta con atrio, claustros bajo y alto, capillas posa, capilla abierta, patio central y un jardín.

A lo largo de su historia el edificio ha tenido varios usos, pues de sede conventual se convirtió sucesivamente en presidio, colegio, cuartel, oficinas del Centro INAH y hasta vivienda de los trabajadores que participaron en las continuas obras de restauración. Los antecedentes del museo se remontan a los tiempos de gobierno del porfiriano Próspero Cahuantzi, cuando se organizó un museo anexo al Colegio de Niñas, el cual desapareció al estallar la Revolución de 1910. Después de efímeros intentos por crear un museo regional, la antropóloga Yolanda Ramos Galicia fue comisionada en 1978 por el Centro Regional INAH Puebla-Tlaxcala para encargarse de esta tarea.

El museo pudo finalmente inaugurarse en 1981 en el ex Convento de Nuestra Señora de la Asunción. Después de algunas labores de reparación a lo largo de los años, se decidió someter al inmueble a una restauración profunda. Se revisó la estructura, actualizó el sistema eléctrico, se tomaron medidas contra la humedad y se verificó el buen funcionamiento del desagüe, entre otras acciones. Reabrió sus puertas el 19 de diciembre de 2015.

La exhibición permanente aborda 12 temas: uno sobre la paleontología en Tlaxcala, cuatro respecto de la época prehispánica, cinco sobre el Virreinato, uno acerca del siglo XIX, y otro sobre la Revolución mexicana. Se muestran 200 piezas con sus respectivas cédulas explicativas: restos óseos muy antiguos, cerámica, escultura pétrea, cuchillos de obsidiana, caracoles labrados y decorados, pinturas, libros, muebles, documentos, fotografías. El acervo abarca 5,000 objetos, que junto con los de reciente recuperación, como los hallados en Quimicho y piezas finas de mayólica de los siglos XVI y XVII, se van turnando en las vitrinas. La exhibición incluye modernos despliegues interactivos.