En 1934, tras la exclaustración definitiva de las monjas agustinas recoletas del Convento de Santa Mónica de Puebla —en aplicación de las Leyes de Reforma incorporadas a las Constituciones de 1857 y 1917—, el edificio se convirtió en el primer Museo de México de Arte Sacro, dedicado a la vida religiosa femenina. Se integró al INAH en 1940. Cuenta con un acervo de arte sacro de los siglos XVI a XIX, conformado en su mayoría por cuatro colecciones de antiguos conventos de la ciudad de Puebla: Santa Mónica (agustinas recoletas), Santa Catalina (dominicas), San Joaquín y Santa Ana (capuchinas) y La Soledad (carmelitas).

En el ex Convento de Santa Mónica, un inmueble del siglo XVII modificado en los siglos posteriores, predomina el estilo barroco poblano, que se observa sobre todo en las fachadas del Patio de Profesas, recubiertas con azulejo de Talavera y con petatillo (ladrillos en ángulo, como costuras de petate). No obstante, la fachada principal de la calle 18 Poniente es de estilo neoclásico.

El museo reconstruye la vida de las religiosas a lo largo de 23 salas de exposición permanente y dos patios, el de Profesas y el de Novicias. Sobresalen las salas de sitio: Placeres, Cocina, Refectorio, Coro Bajo y Alto, Despacho de la Priora, cuenta con salas temáticas como: Vida de San Agustín, Relicarios, Alegorías y Patrocinios, Terciopelos y  Mariana. En estos espacios, además, se despliega un acervo único en su género, compuesto por pinturas religiosas de autores de la época virreinal tan importantes como Juan Correa, Pascual Pérez, Juan de Villalobos, Luis Berrueco, Miguel Cabrera, Nicolás Rodríguez Juárez, Francisco Castillo, Miguel Jerónimo de Zendejas y Rafael Morante, entre otros. También se exhibe esculturas estofadas y de cera; una gran colección de textiles elaborados por las religiosas; bordados y retablos, así como una biblioteca conventual femenina donde se muestran libros y objetos litúrgicos.

Actualmente, en el Museo de Santa Mónica, además de su exposición permanente, se desarrollan exposiciones temporales con investigadores invitados, se ofrecen talleres formativos en las artes plásticas, se imparten conferencias, presentaciones editoriales, conciertos, recorridos guiados y otras actividades académicas y culturales.

La ciudad de Puebla se fundó el 16 de abril de 1531 por la necesidad de la administración virreinal de contar, entre la ciudad de México y el puerto de Veracruz, con una urbe “española” que hiciera contrapeso a la populosa Tlaxcala, del todo indígena y además privilegiada por su colaboración en la Conquista. Durante el periodo novohispano, Puebla llegó a ser una de las metrópolis más importantes, con gran inversión y circulación de bienes y capitales, al grado de recibir el título de “muy noble y muy leal Puebla de los Ángeles”. Allí se fundaron once conventos femeninos, uno de ellos Santa Mónica. En 1688, el obispo Manuel Fernández de Santa Cruz hizo profesar a 24 colegialas bajo la orden de agustinas recoletas, fue el primer convento de esta congregación en América.

A partir de 1857, la promulgación de las Leyes de Reforma, en busca de restar poder a la jerarquía católica (que apoyaba las iniciativas conservadoras, no así siempre los meros sacerdotes), llevó a las religiosas a pasar por continuas exclaustraciones que las obligaron, ya para el siglo XX, a vivir de manera discreta e “ilegal”, ocultas tras los muros de su convento, el cual se mantuvo activo, aunque de manera interrumpida debido a una serie de expulsiones transitorias y sucesivas ocupaciones, hasta el año de 1934, cuando se descubre  el convento y se pone fin a casi 250 años de vida monástica. Fue este monasterio uno de los últimos en ser clausurados en México. Las religiosas se vieron obligadas a vivir en casas particulares, hasta que pudieron adquirir una nueva propiedad.

El inmueble fue puesto a resguardo de la Secretaría de Hacienda y Crédito Público y de la Dirección de Bienes Nacionales de Puebla, responsables por ley, de la salvaguarda del patrimonio artístico e histórico. El ex convento ya para entonces, se convirtió en depósito de objetos de arte decomisados principalmente a cuatro conventos femeninos de la ciudad y del propio de Santa Mónica. En 1935 se convierte en el primer Museo de Arte Religioso de la República Mexicana. El mismo año, por decreto presidencial del general Lázaro Cárdenas, se acuerda que la Secretaria de Educación Pública se haga cargo del inmueble, lo que ocurre hasta 1940, cuando pasa a la jurisdicción del recién creado  Instituto Nacional de Antropología e Historia.