Se encuentran justo debajo del presbiterio de la iglesia. Espacio de enorme calidad estética y arquitectónica, y uno de los mejor conservados de entre los antiguos conventos de la Nueva España. Aquí eran enterrados los frailes y sus benefactores, lo que explica su lujosa ornamentación, también basada en juegos de azulejo y pintura mural. El escudo de armas del Sargento Mayor Juan de Ortega y Valdivia evidencia que fue el dueño de la cámara más lujosa. Este espacio fue restaurado en 1990.  El pequeño retablo central es, junto con el de capilla doméstica, el único original que ha sobrevivido. Enmarca el lienzo del siglo XVII El Señor de la Columna, que inspiró a Villalpando en uno de sus lienzos de sacristía. Milagrosamente permanece en su sitio, ya que se tiene registro fotográfico de obras de arte que decoraban este espacio y que desaparecieron. Con influencias manieristas, el cuadro fue atribuido por Manuel Toussaint a Baltasar de Echave Orio, uno de los pilares del arte novohispano. Fue aquí en donde en 1916, tropas zapatistas excavaron en busca de presuntos tesoros legendarios; pero para su sorpresa, sólo encontraron doce cadáveres momificados por la naturaleza del subsuelo. 

El descubrimiento de las momias fue un gran suceso en la comunidad, al grado de que cuando un fraile intentó darles sepultura enfrentó una firme oposición de los pobladores que ya las habían adoptado como parte de su comunidad.