Tan importante como la conquista militar, tecnológica o artística, fue la evangelización, también llamada "conquista espiritual". Esta labor fue realizada en los primeros años por religiosos pertenecientes a las órdenes franciscana, dominica y agustina, y más tarde por los jesuitas y el clero diocesano (formado por sacerdotes y diáconos de una diócesis).

Con el fin de hacer más atractiva la nueva fe para los indígenas, las ceremonias religiosas se acompañaban de música, danzas (pronto se admitieron danzas indígenas), cantos, flores, velas e incienso. También se escenificaban autos sacramentales o pequeñas piezas teatrales para explicar la doctrina cristiana. Los religiosos utilizaron a los niños de la nobleza indígena, previamente educados en los conventos y colegios, como catequistas y, más tarde, algunos de ellos continuaron propagando la fe cristiana al transformarse en gobernadores y jueces de los pueblos de indios.

Los evangelizadores concentraron a las comunidades indígenas en poblados, y permitieron la convivencia de los sistemas y formas de organización prehispánica y castellana de tenencia comunal de la tierra; introdujeron el uso de la rueda y las herramientas de hierro, así como diversos cultivos y animales europeos.

Escribieron obras fundamentales en las múltiples lenguas nativas y no pocas veces defendieron a los pueblos indios de los abusos de encomenderos, corregidores, terratenientes, mineros, y aun de sus propios caciques.